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Esplora questa rivista & gt; Articolo precedente nel numero: GATA-binding protein-3 regola T helper di tipo 2 citochine e IFNG loci attraverso l'interazione con le metastasi-proteina associata 2 Prossimo articolo in questione: la differenziazione delle cellule dendritiche con risultati prostaglandina E2 in attenuazione selettivo della via di segnale chinasi legate extracellulare e diminuzione di interleuchina-23 Visualizza problema TOC Volume 131, Issue 1 settembre 2010 Pagine 59 & ndash; 66 Seladin-1 è un romanzo lipopolisaccaride (LPS) gene - responsive e inibisce il fattore di necrosi tumorale alfa &; produzione e osteoclasti formazione in risposta a LPS autori Imtiaz I.-E. Khuda, Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, Aichi Medical University School of Medicine, Nagakute, Aichi, in Giappone Cerca altre carte di questo autore Naoki Koide, Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, Aichi Medical University School of Medicine, Nagakute, Aichi, in Giappone Cerca altre carte di questo autore Abu S. M. Noman, Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, Aichi Medical University School of Medicine, Nagakute, Aichi, in Giappone Cerca altre carte di questo autore Jargalsaikhan Dagvadorj, Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, Aichi Medical University School of Medicine, Nagakute, Aichi, in Giappone Cerca altre carte di questo autore Gantsetseg Tumurkhuu, Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, Aichi Medical University School of Medicine, Nagakute, Aichi, in Giappone Cerca altre carte di questo autore Yoshikazu Naiki, Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, Aichi Medical University School of Medicine, Nagakute, Aichi, in Giappone Cerca altre carte di questo autore Takayuki Komatsu, Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, Aichi Medical University School of Medicine, Nagakute, Aichi, in Giappone Cerca altre carte di questo autore Tomoaki Yoshida, Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, Aichi Medical University School of Medicine, Nagakute, Aichi, in Giappone Cerca altre carte di questo autore Takashi Yokochi Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, Aichi Medical University School of Medicine, Nagakute, Aichi, in Giappone Cerca altre carte di questo autore T. Yokochi, Dipartimento di Microbiologia e Immunologia, Aichi Medical University School of Medicine, Nagakute, Aichi 480-1195, Giappone. E-mail: yokochi@aichi-med-u. ac. jp senior autore: Takashi Yokochi sommario Selective Indicatore-1 malattia di Alzheimer (Seladin-1) è una ossidoriduttasi ampiamente espresso ed è correlata alla malattia di Alzheimer, il metabolismo del colesterolo e carcinogenesi. L'effetto di lipopolisaccaride (LPS) sull'espressione di Seladin-1 è stata esaminata usando RAW cellule 264.7 macrofagi-simili e macrofagi peritoneali murini. Lipopolisaccaride indotta l'espressione di Seladin-1 proteine e RNA messaggero in quei macrofagi. L'espressione Seladin-1 è stata aumentata anche da una serie di ligandi dei recettori Toll-like. L'LPS aumentato l'espressione di Seladin-1 tramite reattive generazione specie di ossigeno e l'attivazione di p38. attivazione di p38 Seladin-1 inibiti LPS-indotta, ma non factor-nucleare e kappa, B e inibito la produzione di necrosi tumorale factor-alpha &; in risposta a LPS. Inoltre, Seladin-1 inibiti LPS-indotta la formazione di osteoclasti e una maggiore attività di fosfatasi alcalina LPS-indotta. Pertanto, è stato suggerito che Seladin-1 potrebbe essere un prodotto genico LPS-responsabile e regolare la risposta infiammatoria indotta da LPS negativamente. saggio ELISA extracellulare chinasi del segnale regolate siero fetale bovino gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi MAP-chinasi fattore stimolante le colonie di macrofagi N - acetyl - l cisteina reazione a catena della polimerasi recettore attivatore di NF-kappa &; & Beta; ligando specie reattive dell'ossigeno Selective Indicatore-1 malattia di Alzheimer piccoli RNA interferenti fattore di necrosi tumorale alfa &; tartrato resistente fosfatasi acida introduzione Seladin-1 è un omologo umano della pianta minuto / gene DWARF1, descritto principalmente in Arabidopsis thaliana. situato nel reticolo endoplasmatico e, in misura minore, nel Golgi ed espressa in tutti i tipi di cellule. 1 & ndash; 5 L'espressione di Seladin-1 in aree del cervello si riduce in Alzheimer & rsquo; s malattia, quindi è & rsquo; s nome & ndash; Seladin-1 (malattia di Alzheimer selettiva Indicatore-1). 4,5 Seladin-1 è coinvolta nella protezione delle cellule dallo stress ossidativo come perossido di idrogeno (H 2 O 2) scavenger. 6 Seladin-1 espressione è migliorata sotto stress acuto e l'espressione aumentata conferisce la resistenza al H 2 O 2 tossicità indotta, che è mediata da un aumento biosintesi del colesterolo cellulare. 7 D'altra parte, l'esposizione cronica a stress ossidativo diminuisce Seladin-1, ma l'effetto protettivo è ancora mantenuto attraverso ubiquitinazione p53 elevato. 7 Seladin-1 è anche identico al DNA complementare DHCR24 umana, che è una ossidoriduttasi ampiamente espresse e catalizza la riduzione del & Delta; 24 doppio legame in desmosterolo per la produzione di colesterolo. 8 La mutazione di Seladin-1 provoca desmosterolosi, una rara malattia autosomica recessiva, accompagnato da anomalie gravi, come osteosclerosi generalizzata, più malformazioni congenite e alterazioni neuropsicologiche. 8 & ndash; 10 Lipopolisaccaride (LPS) è un componente del Gram-negativi parete cellulare batterica e provoca una varietà di risposte infiammatorie attraverso eccessivo rilascio di mediatori pro-infiammatori. 11 LPS è riconosciuto da Toll-like receptor 4 (TLR-4) e determinerà l'attivazione di una serie di percorsi di segnale tra cui factor-nucleare e kappa; B (NF-& kappa; B), proteina chinasi mitogeno-attivata (MAPK) e phosphoinositide 3 chinasi. 11 Successivamente LPS innesca la produzione di un numero di mediatori pro-infiammatori, come tumor necrosis factor-alpha &; (TNF-alfa e;), interleuchine e l'ossido nitrico nei macrofagi. 12 lipopolisaccaride porta anche alla generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS). 13 Abbiamo riferito che LPS induce la formazione degli osteoclasti nei macrofagi via TNF-alfa &; produzione. 14,15 cross-talk tra Seladin-1 e LPS può pertanto presumere, anche se non vi è alcun rapporto di una relazione tra Seladin-1 e LPS. Nel presente studio, abbiamo esaminato l'effetto di LPS sull'espressione Seladin-1, e il coinvolgimento di Seladin-1 nel LPS-indotta TNF-alfa &; produzione e riassorbimento osseo nei macrofagi. Si segnala che Seladin-1 è un prodotto del gene LPS-responsabile che regola negativamente LPS-indotta riassorbimento osseo infiammatoria. Materiali e metodi reagenti L'LPS da Escherichia coli O111, colesterolo e N - acetyl - l cisteina (NAC) sono stati ottenuti da Sigma (St. Louis, MO). Gli anticorpi anti-p38, p38 fosforilata (PP38), proteina chinasi attivata da stress (SAPK / JNK), SAPK fosforilata, extracellulare segnale regolate chinasi (ERK 1/2), ERK fosforilata 1/2, p53, AKT e immunoglobulina coniglio G sono stati acquistati da cellulare Segnalazione Technology (Beverly, MA). Coniglio anti-DHCR24 (alternativa simbolo Seladin-1) anticorpo è stato ottenuto da proteine Tech Group (Chicago, IL). BAY 11-7082, SB203508 e SP600125 sono stati ottenuti da Calbiochem (La Jolla, CA) e nutlin-3 è stato acquistato da Cayman Chemical (Ann Arbor, MI). Ricombinante del recettore murino attivatore di NF-kappa &; & Beta; ligando (RANKL) è stato acquistato da Peprotech Inc. (Rocky Hill, NJ). Ricombinante topo macrofagi fattore stimolante le colonie (M-CSF) è stato acquistato da R & amp; D Systems (Minneapolis, MN) e il mouse ricombinante TNF-alfa &; e H 2 O 2 è stato fornito dalla Wako (Osaka, Giappone). Coltura cellulare La linea cellulare macrofagica-like murino RAW 264.7 stato ottenuto da Riken Cell Bank (Tsukuba, Giappone) e mantenuta in terreno RPMI-1640 contenente 10% inattivato al calore vitello siero fetale (FCS; Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) e antibiotici a 37 & deg; nel 5% di CO 2. cellule peritoneali sono stati raccolti da topi BALB / c (Giappone SLC, Hamamatsu, Giappone) 3 giorni dopo un'iniezione intraperitoneale di 1 ml sterile al 10% Thioglycollate (Remel, Kansas City, MO). Thioglycollate-suscitato cellule peritoneali sono stati ottenuti lavando la cavità peritoneale con RPMI-1640 (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD) contenente 5% FCS. Le cellule sono state sospese in terreno RPMI-1640 contenente 5% FCS senza antibiotici e incubate in un piatto di plastica per 5 ore. Le cellule aderenti i macrofagi peritoneali sono stati incubati con mezzo RPMI-1640 contenente 5% FCS e antibiotici a 37 & deg; in un umidificata al 5% CO 2 incubatore per 24 ore. Gli esperimenti sugli animali sono stati eseguiti seguendo la guida per cura e l'uso di animali da laboratorio, Aichi Medical University. Transfection di small interfering (si) RNA Seladin-1-specifica siGENOME 1 obiettivi più piscina SMART e un siRNA non-targeting sono stati ottenuti da Dharmacon (Chicago, IL). RAW 264.7 cellule sono state seminate ad una concentrazione di 2 & volte; 10 5 cellule / pozzetto in una piastra da 48 pozzetti in terreno di crescita senza antibiotici. complessi di lipidi cationici sono stati preparati incubando 200 o 400 n m siRNA con 3 & mu; l Hiperfect trasfezione reagente (Qiagen, Hilden, Germania) in 50 & mu; l mezzo senza FCS e sono stati poi aggiunti alle cellule. Dopo 8 ore di incubazione, le cellule sono state ulteriormente coltivate con terreno fresco crescita (200 & mu; l) senza antibiotici per 2 giorni. L'efficienza del Seladin-1 silenziamento è stata valutata mediante immunoblotting e Real time PCR (PCR). immunoblotting L'immunoblotting è stata eseguita come descritto altrove. 16 In breve, i lisati cellulari sono stati estratti dal tampone di lisi e sono stati sottoposti a dodecil solfato di sodio & ndash; poliacrilamide elettroforesi su gel utilizzando un gel al 10% in condizioni riducenti. Le proteine sono state trasferite elettricamente ad una membrana e le membrane sono state trattate con diversi anticorpi, seguito da anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano. Le bande proteiche sono state visualizzate usando un reagente chemiluminescenza (Pierce, Rockford, IL). Per ri-sondaggio, le membrane sono state spogliate con la soluzione contenente 2% di solfato di sodio dodecil, 62 & middot; 5 m m Tris & ndash; HCl a pH 6 & middot; 8, 100 m m 2-mercaptoetanolo a 50 & deg; per 30 minuti e trattata con anticorpi corrispondenti. Le dimensioni molecolari degli antigeni sono state determinate per confronto con un pre-tinto kit marcatore di formato proteine (Invitrogen, Carlsbad, CA). NF-kappa e; attivazione B Il legame di NF-kappa &; B p65 subunità alla NF-kappa &; B vincolante sequenza consenso 5 & prime; - GGGACTTTCC-3 & prime; è stata determinata con il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) a base di Trans AM NF-kappa &; Kit B p65 (Motif attivo, Carlsbad, CA) secondo il costruttore & rsquo; s istruzioni. In breve, gli estratti nucleari sono stati preparati utilizzando un kit estratto nucleare (Active Motif) e applicate al kit Trans-AM 96 pozzetti micropiastra rivestiti con un oligonucleotide contenente la NF-kappa &; B vincolante sequenza consenso. La forma attiva della NF-kappa &; B p65 subunità è stata rilevata con il produttore e rsquo; s istruzioni che sia accessibile solo quando la subunità viene attivato e legato al suo DNA bersaglio. I risultati sono espressi come valore di attivazione di p65, è stato determinato con l'assorbanza a 450 nm. La fosforilazione di NF-kappa &; B p65 è stato analizzato anche da immunoblotting. Determinazione del TNF-alfa &; e interleuchina-6 RAW 264.7 cellule sono state coltivate con LPS a 100 ng / ml per 6 e 24 ore. La concentrazione di TNF-alfa e; nel supernatante di coltura è stato determinato mediante ELISA (R & amp; D Systems, Minneapolis, MN). In alcuni esperimenti, le cellule sono state pre-trattati con colesterolo (10 & mu; g / ml) per 6 ore o nutlin-3 (2 & middot; 5 & mu; m) per 1 ora prima della stimolazione LPS. La concentrazione di interleuchina-6 (IL-6) nel surnatante cultura è stato anche determinato utilizzando ELISA (BioSource, Camarillo, CA). Real-time PCR Quantitativa real-time PCR è stata eseguita come descritto altrove. 16 RNA è stato estratto dalle cellule utilizzando il kit RNeasy Mini (Qiagen, Chatsworth, CA). RNA è stato retrotrascritto a ReverTra Ace (Toyobo, Osaka, Giappone) con una incubazione in tre fasi secondo il costruttore & rsquo; s istruzioni, e PCR quantitativa è stata effettuata utilizzando il real-time PCR Master Mix verde SYBR (Toyobo) a seguito della istruzioni s; produttore & rsquo. I primer sono stati progettati come segue: Seladin-1 (senso 5 & prime; - CACAGGCATCGAGTCATCGT-3 & prime ;, anti-senso 5 & prime; - GGCACGGCATAGAACAGGTC-3 & prime;), TNF-alfa e; (Senso: 5 & prime; - TGTTGCCTCCTCTTTTGCTT-3 & prime; anti-senso: 5 & prime; - TGGTCACCAA-AATCAGCGTTA-3 & prime;); gliceraldeide 3-fosfato deidrogenasi (GAPDH) (senso: 5 & prime; - TGAAGCAGGCATCTGAGGG-3 & prime ;, anti-senso: 5 & prime; - CGAAGGTGGAAGAGTGGGAG-3 & prime;) (Invitrogen). La PCR è stata eseguita con un PRISM 7700 sistema di rilevazione sequenza ABI (Applied Biosystems, Hamilton, Nuova Zelanda) e le condizioni di PCR erano come segue: 95 & deg; per 10 min e 40 cicli a 95 & deg; per 30 secondi, 60 & deg; per 1 min. valori quantitativi relativi di Seladin-1 e TNF-alfa &; espressione stati normalizzati utilizzando i livelli di espressione del gene GAPDH di riferimento. Tartrato resistente fosfatasi acida colorazione fosfatasi acida (TRAP) colorazione tartrato resistente stata effettuata per identificare osteoclasti. Brevemente, le cellule sono state lavate con PBS e trattate con una soluzione di fissaggio a temperatura ambiente per 5 min. Le cellule sono state lavate con acqua distillata e colorate con TRAP reagente (Wako, Osaka, Giappone) a 37 & deg; per 60 min. Dopo lavaggio con acqua distillata, le cellule sono state osservate al microscopio. Le immagini sono state scattate con una fotocamera digitale collegata ad un microscopio. Più di 150 cellule sono state contate al microscopio per la frequenza di cellule TRAP-positive. In alcuni esperimenti, le cellule sono state pre-incubate con ricombinante TNF alpha &; (25 ng / ml) per 1 ora prima del trattamento con LPS. saggio della fosfatasi alcalina L'attività della fosfatasi alcalina (ALP) è stato determinato come descritto altrove. 15 In breve, RAW 264.7 cellule sono state stimolate con LPS 100 ng / ml in una piastra da 96 pozzetti per 2 giorni. Una soluzione saggio enzimatico (200 & mu; l) contenente 8 MMP fosfato - nitrophenyl da 12 mm MgCl 2 e 0 & middot; 1 millimetro ZnCl 2 a 0 & middot; 1 m glicina & ndash; NaOH tampone a pH 10 & middot; 5 sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e la piastra è stato incubato a 37 & deg; per 10 min. La reazione enzimatica è stata terminata da 0 & middot; 5 M di NaOH e la quantità di p - nitrophenol rilasciato è stata determinata con l'assorbanza a 405 nm. Analisi statistica Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti almeno tre volte in modo indipendente. I dati sperimentali sono espressi come media di triplicati & plusmn; deviazione standard in almeno tre esperimenti indipendenti. L'analisi statistica basata su Student & rsquo; s t-test è stato effettuato per il confronto tra due esperimenti. Un valore di P & lt; 0 & middot; 01 è stato considerato statisticamente significativo. risultati LPS induce l'espressione di Seladin-1 nelle cellule RAW264.7 e mouse macrofagi peritoneali L'effetto di LPS sull'espressione di Seladin-1 in cellule RAW264.7 stato esaminato. Le cellule RAW 264.7 state stimolate con diverse concentrazioni di LPS per 4 ore e l'espressione di Seladin-1 proteina è stato determinato mediante immunoblotting (Fig. 1a). Seladin-1 solo marginalmente espresso in cellule non trattate di controllo. LPS a 1 e 10 ng / ml leggermente aumentata l'espressione Seladin-1 e LPS a 100 ng / ml indotto la più alta espressione di Seladin-1. D'altra parte, LPS a 1000 ng / ml ridotto l'espressione Seladin-1. cellule RAW264.7 sono state stimolate con LPS (100 ng / ml) per varie ore e il tempo & ndash; corso dell'espressione Seladin-1 è stato seguito (Fig 1b.). Seladin-1 è aumentata di 1 ora dopo stimolazione con LPS, ha raggiunto un picco a 4 ore, e poi scendere gradualmente. L'espressione LPS-indotta Seladin-1 RNA messaggero (mRNA) è stata esaminata mediante real-time PCR (Fig. 1c). L'espressione di Seladin-1 mRNA era aumentata in modo significativo 1 ora dopo stimolazione con LPS e aumentato fino a 4 ore. Inoltre, l'effetto di LPS sull'espressione di Seladin-1 è stata esaminata usando topo macrofagi peritoneali (Fig. 2). La somministrazione di LPS a 100 ng / ml indotta l'espressione più alta Seladin-1 nei macrofagi peritoneali nonché RAW 264.7 cellule (Fig. 2a). L'espressione Seladin-1 è stata aumentata 2 e 4 ore dopo la stimolazione con LPS (Fig. 2b). Figura 1. & ENSP; Induzione di Seladin-1 da lipopolisaccaride (LPS). (A) RAW 264.7 cellule sono state stimolate con diverse concentrazioni di LPS per 4 ore. (B) RAW 264.7 cellule sono state stimolate con LPS (100 ng / ml) per varie lunghezze di tempo. L'espressione di Seladin-1 proteina è stata determinata con immunoblotting. (C) RAW 264.7 cellule sono state stimolate con LPS (100 ng / ml) per 4 ore. L'espressione di Seladin-1 RNA messaggero è stato determinato in tempo reale la reazione a catena della polimerasi. Viene mostrato un tipico esperimento di tre esperimenti indipendenti. Figura 2. & ENSP; Induzione di Seladin-1 da lipopolisaccaride (LPS) e vari ligandi dei recettori Toll-like (TLR). (A) i macrofagi peritoneali murini sono state stimolate con diverse concentrazioni di LPS per 4 ore. (B) macrofagi peritoneali murini sono state stimolate con LPS (100 ng / ml) per varie lunghezze di tempo. (C) RAW 264.7 cellule sono state stimolate con LPS (100 ng / ml), Pam3CysSK4 (10 & mu; g / ml), poli I. C (10 & mu; g / ml), imiquimod R837 (10 & mu; g / ml) e CpG DNA (10 & mu; m) come TLR-4, -2 -3, -7 e -9 ligandi, rispettivamente, per 4 ore. L'espressione di Seladin-1 proteina è stata determinata con immunoblotting. Viene mostrato un tipico esperimento di tre esperimenti indipendenti. Inoltre, l'effetto di altri TLR ligandi sull'espressione Seladin-1 è esaminato (Fig. 2c). RAW 264.7 cellule sono state stimolate con LPS (100 ng / ml), Pam3CysSK4 (10 & mu; g / ml), poli I. C (10 & mu; g / ml), imiquimod R837 (10 & mu; g / ml) e CpG DNA (10 & mu; m) come TLR-4, -2, -3, -7 e -9 ligandi rispettivamente, per 4 ore e l'espressione Seladin-1 è stato determinato mediante immunoblotting. L'LPS e Pam3CysSK4 indotto più alta espressione di Seladin-1 di poli I: C, Imiquimod R837 e CpG DNA. LPS fa scattare l'espressione di Seladin-1 attraverso la generazione di ROS e l'attivazione di p38 Per chiarire i segnali di attivazione indotta da LPS Seladin-1, l'effetto di NAC come ROS scavenger 17 o SB203580 come inibitore farmacologico p38 su LPS-indotti Seladin-1 è stata esaminata. RAW 264.7 cellule sono state stimolate con LPS (100 ng / ml) per 2 ore in presenza o assenza di NAC (15 m m) o SB203580 (10 & mu; m). L'espressione Seladin-1 è stata determinata mediante immunoblotting. L'aggiunta di NAC o SB203580 definitivamente aboliti LPS-indotta Seladin-1 (Fig. 3a). Sebbene l'effetto di una serie di inibitori di segnale su LPS-indotta Seladin-1 è stato esaminato, nessuno di loro, tra cui BAY 11-7082 (10 & mu; m) come NF - & kappa; inibitore B e SP600125 (10 & mu; m ) come inibitore SAPK / JNK esposto un'azione inibitoria su di essa (dati non mostrati). Inoltre, RAW 264.7 cellule sono state pre-incubate con 25 & mu; m H 2 O 2 per 1 ora e poi trattate con LPS 100 ng / ml per 2 ore. Il trattamento con H 2 O 2 significativamente aumentata espressione Seladin-1 in presenza o assenza di LPS (Fig. 3b), suggerendo che ROS e p38 accresce l'espressione Seladin-1. Figura 3. & ENSP; coinvolgimento di specie reattive dell'ossigeno (ROS) e p38 nel lipopolisaccaride (LPS) indotta Seladin-1. (A) RAW 264.7 cellule sono state pretrattate con N - acetyl - l cisteina (NAC; 15 mm) come inibitore ROS o SB203580 (10 & mu; m) come inibitore p38 per 2 ore e stimolate con LPS (100 ng / ml) per 4 ore. (B) RAW 264.7 cellule sono state pretrattate con H 2 O 2 (25 & mu; m) per 1 ora e stimolate con LPS (100 ng / ml) per 2 ore. L'espressione di Seladin-1 proteina è stata determinata con immunoblotting. Viene mostrato un tipico esperimento di tre esperimenti indipendenti. Seladin-1 inibisce l'attivazione di p38 LPS-indotta Nel paragrafo precedente abbiamo dimostrato che LPS aumentata l'espressione Seladin-1 tramite la generazione di ROS e l'attivazione di p38. D'altra parte, Seladin-1 è segnalato per aumentare H 2 O 2 p38 indotta e l'attivazione SAPK / JNK tramite un meccanismo sconosciuto. 6 E 'possibile che Seladin-1 potrebbe influenzare l'attivazione di una serie di MAPK in risposta a LPS e H 2 O 2. RAW 264.7 cellule sono state trasfettate con Seladin-1 siRNA e stimolate con LPS (100 ng / ml) per 1 ora e la fosforilazione di p38, SAPK / JNK e ERK1 / 2 è stato determinato mediante immunoblotting. In primo luogo, abbiamo confermato il silenziamento dell'espressione della proteina Seladin-1 da Seladin-1 siRNA (Fig. 4a). Utilizzando l'effettiva Seladin-1 siRNA, l'effetto di Seladin-1 siRNA sulla fosforilazione di p38, SAPK / JNK e ERK1 / 2 è stata esaminata in LPS-stimolati RAW 264.7 cellule (Fig. 4b). Introduzione del Seladin-1 siRNA aumentato la fosforilazione di p38, ma non SAPK / JNK e ERK1 / 2 in risposta a LPS (Fig. 4b). D'altra parte, i siRNA controllo negativo omesso di farlo. Figura 4. & ENSP; Effetto del Seladin-1 small interfering (si) RNA su lipopolisaccaride (LPS) indotta attivazione di p38. RAW 264.7 cellule sono state trasfettate con Seladin-1 siRNA o siRNA controllo negativo per 48 ore e stimolate con LPS (100 ng / ml) per 1 ora. L'espressione di Seladin-1 proteina (a) e p38 fosforilato (PP38), pERK1 / 2, pSAPK / JNK (b) sono stati determinati con immunoblotting. (C) Le cellule trasfettate sono state stimolate con LPS (100 ng / ml) per 30 min. Il legame del attivato p65 factor-nucleare e kappa; B (NF-kappa &; B) subunità a un NF-kappa &; B sequenza consenso è stato determinato con il NF-kappa &; vincolante B DNA kit. (D) Le cellule trasfettate sono state stimolate con LPS (100 ng / ml) per 60 e 120 min. L'espressione della proteina p53 è stata determinata con immunoblotting. quantificazione relativa di immunoblot è stato analizzato mediante densitometria e il risultato è mostrato come media di tre esperimenti con SD (b, d). Successivamente, l'effetto di Seladin-1 siRNA su NF-kappa e LPS-indotta; attivazione di B è stato esaminato dal fosforilazione e l'attività di legame al DNA di p65 NF-kappa &; B. Seladin-1 siRNA non ha alterato la fosforilazione (dati non riportati) e l'attività di legame al DNA di NF-kappa e, (Fig. 4c) B. Inoltre, Seladin-1 è segnalato per stabilizzare la proteina p53 indipendentemente dalla sua attività ossidoreduttasi e di accumulare p53 attraverso spostando l'E3 ubiquitina ligasi Mdm2 da p53, 17 e un altro recente rapporto ha suggerito che l'epatite C virus-mediata persistente sovra-espressione di Seladin-1 sopprime l'attività di p53. 18 Pertanto, l'effetto di Seladin-1 siRNA sull'espressione di p53 è stato esaminato. Non vi era alcuna differenza significativa nella accumulo di p53 LPS-indotta tra Seladin-1 siRNA e controllo siRNA (Fig. 4d). Seladin-1 inibisce la produzione di TNF-alfa e; in LPS-stimolati cellule RAW264.7 Come era stato trovato Seladin-1 per inibire LPS-indotta attivazione di p38 (Fig 4b.) E perché LPS-indotta TNF-alfa &; produzione dipende dalla attivazione di p38 e NF-kappa &; B, 11,12,19 l'effetto di Seladin-1 siRNA su LPS-indotta TNF alpha &; la produzione è stata esaminata. Seladin-1 o cellule di controllo siRNA-trasfettate sono state stimolate con LPS (100 ng / ml) per 6 o 24 ore. Introduzione del Seladin-1 siRNA nelle cellule aumentata la produzione di TNF-alfa &; in risposta a LPS (Fig. 5a) considerando introduzione di siRNA di controllo non ha fatto. Il TNF-alfa &; la produzione è stata anche aumentata in Seladin-1 le cellule siRNA-trasfettate 24 ore dopo la stimolazione LPS (Fig. 5b). Successivamente, l'effetto di Seladin-1 siRNA su LPS-indotta TNF alpha &; espressione di mRNA è stato esaminato (Fig. 5c). Seladin-1 siRNA significativamente aumentata l'espressione di TNF-alfa &; mRNA in cellule stimolate con LPS, suggerendo che Seladin-1 inibiti LPS-indotta TNF alpha &; produzione tramite p38 l'inattivazione. Seladin-1 o controllare le cellule siRNA-trasfettate sono state pre-incubate con colesterolo o nutlin-3, che inibisce l'interazione p53-Mdm2, e quindi stimolati con LPS (100 ng / ml) per 6 ore. L'aggiunta di colesterolo e nutlin-3 non è riuscito a inibire Seladin-1-indotta TNF-alfa &; l'aumento, suggerendo alcun coinvolgimento di colesterolo e p53 nel aumento del TNF-alfa &; produzione Seladin-1 (dati non mostrati). L'effetto di Seladin-1 siRNA su LPS-indotta di IL-6 è stato inoltre esaminato (Fig. 5d). Introduzione del Seladin-1 siRNA portato alla produzione aumentata di IL-6 in risposta a LPS. Figura 5. & ENSP; Effetto del Seladin-1 small interfering (si) RNA su lipopolisaccaride (LPS) indotta fattore di necrosi tumorale (TNF-alpha &;) di produzione. RAW 264.7 cellule sono state trasfettate con Seladin-1 siRNA o siRNA controllo negativo per 48 ore e le cellule trasfettate sono state stimolate con LPS (100 ng / ml) per 6 (a) e 24 ore (b). (C) il livello di TNF-alfa &; nel surnatante cultura è stata determinata mediante saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). Trasfettate o cellule di controllo sono state stimolate con LPS (100 ng / ml) per 1 ora. L'espressione di TNF-alfa e; RNA messaggero è stato determinato in tempo reale la reazione a catena della polimerasi. (D) trasfettata o cellule di controllo sono state stimolate con LPS (100 ng / ml) per 6 h e il livello di interleuchina-6 (IL-6) nel supernatante di coltura è stato determinato con ELISA. * P & lt; 0 & middot; 01 contro siRNA di controllo. Seladin-1 aumenta la formazione di osteoclasti LPS-indotta ed il riassorbimento osseo Lipopolisaccaride indotta la formazione di osteoclasti e la sopravvivenza dipendono esclusivamente TNF-alfa &; produzione e TNF-alfa &; gioca un ruolo centrale nella patogenesi del riassorbimento osseo indotta da LPS. 14,15 Dal Seladin-1 le cellule siRNA-trasfettate prodotto una maggiore quantità di TNF-alfa &; in risposta a LPS (Fig. 5), Seladin-1 potrebbe influenzare la formazione degli osteoclasti indotta da LPS. Pertanto, l'effetto di Seladin-1 siRNA sulla formazione degli osteoclasti indotta da LPS è esaminato (Fig. 6a). Seladin-1 o cellule di controllo siRNA-trasfettate sono state stimolate con LPS (100 ng / ml) per 48 ore e la frequenza di formazione degli osteoclasti è stato determinato con TRAP colorazione. LPS indotto la maggiore frequenza di TRAP + cellule (osteoclasti) in Seladin-1 le cellule siRNA-trasfettate rispetto alle cellule siRNA-trasfettate controllo, suggerendo la regolazione negativa della formazione di osteoclasti LPS-indotta da Seladin-1. L'aggiunta di TNF-alfa esogeno &; (25 ng / ml) è aumentato ulteriormente la frequenza degli osteoclasti figurano formazione degli osteoclasti indotta da LPS (circa 14%) e il valore era quasi la stessa di quella delle cellule Seladin-1-siRNA transfettate LPS-stimolati (15%, Fig . 6a). Figura 6. & ENSP; Effetto del Seladin-1 small interfering (si) RNA su lipopolisaccaride (LPS) indotta la formazione degli osteoclasti e fosfatasi alcalina (ALP). RAW 264.7 cellule sono state trasfettate con Seladin-1 siRNA o siRNA controllo negativo per 48 ore e le cellule trasfettate sono state stimolate con LPS (100 ng / ml) per 48 ore. (A) La frequenza degli osteoclasti è stata determinata con tartrato fosfatasi acida resistente colorazione. (B) L'attività ALP è stata misurata usando un saggio enzimatico utilizzando p - nitrophenol come substrato. * P & lt; 0 & middot; 01 contro siRNA di controllo. (C) RAW 264.7 cellule sono state stimolate con recettore attivatore di factor-nucleare e kappa; & Beta; ligando (RANKL, 100 ng / ml) e il fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF, 25 ng / ml) per diversi periodi di tempo. L'espressione di Seladin-1 proteina è stata determinata con immunoblotting (d). Viene mostrato un tipico esperimento di tre esperimenti indipendenti. L'effetto di Seladin-1 sull'attività ALP come marker del riassorbimento osseo in LPS-simulati RAW 264.7 cellule è esaminato (Fig. 6b). RAW 264.7 cellule sono state trasfettate con Seladin-1 o controllare siRNA e quindi stimolate con LPS (100 ng / ml) per 48 ore. L'attività di ALP in-1 Seladin cellule siRNA-trasfettate era inferiore nelle cellule siRNA-trasfettate controllo. L'effetto di RANKL e M-CSF sull'espressione Seladin-1 è stata esaminata. RAW 264.7 cellule sono state trattate con RANKL (100 ng / ml) e M-CSF (25 ng / ml) per diversi periodi di tempo. L'espressione Seladin-1 è aumentata in modo significativo 2 ore dopo il trattamento, ha raggiunto un picco a 6 & ndash; 8 ore ed è diminuita gradualmente (Fig 6c.). Discussione In questo studio dimostriamo che Seladin-1 è un gene LPS-reattiva e negativamente regola il TNF-alfa &; produzione e riassorbimento osseo in risposta a LPS. L'LPS induce l'espressione di Seladin-1 nei macrofagi e aumentata Seladin-1 inibisce le risposte infiammatorie indotta da LPS, come TNF-alpha &; e IL-6. Pertanto, Seladin-1 è un regolatore negativo del segnale LPS. Inoltre, altri TLR ligandi aumentare l'espressione di Seladin-1 nei macrofagi. Pertanto, Seladin-1 è suggerito per essere un gene TLR-reattivo e negativamente regola la risposta infiammatoria TLR-indotta. Quindi, Seladin-1 potrebbe svolgere un ruolo fondamentale nella regolazione valutazioni di immunità innata. ras oncogeni e lo stress ossidativo (H 2 O 2) sono segnalati per indurre l'espressione di Seladin-1 attraverso la via del segnale ROS. 17 Ciò è stato confermato anche da questo studio. Il percorso del segnale ROS è attualmente l'unica via di segnale stabilito per Seladin-1 attivazione nella carcinogenesi. 17 D'altra parte, il presente studio dimostra il coinvolgimento di p38 e ROS in LPS-indotta Seladin-1. Lipopolisaccaride fa sì che la produzione di ROS 13 e generato ROS è noto per provocare l'attivazione del pathway di segnale ossidativo p38 legati allo stress. 20 E 'ragionevole che LPS-indotta Seladin-1 richiede l'attivazione di entrambi i ROS e percorsi di segnale p38. D'altra parte, solo ROS segnalazione sembra essere richiesta per carcinogenesi. 17 L'espressione genica Seladin-1 potrebbe richiedere ogni percorso diverso segnale in risposta ad una varietà di stimoli. Lipopolisaccaride indotta TNF-alfa &; la produzione è regolata da percorsi p38, SAPK / JNK e ERK1 / 2 MAPK così come la NF-kappa &; B percorso. 21 Bloccare uno dei tre percorsi MAPK tra ERK1 / 2, SAPK / JNK e p38 è sufficiente a inibire il TNF-alfa &; produzione in risposta a LPS. 19,21 Seladin-1 è indicata di inibire l'attivazione di p38 nel presente studio. Pertanto, è ragionevole che Seladin-1 inibisce LPS-indotti TNF alpha &; produzione attraverso l'attivazione di p38 ridotta. Inoltre, abbiamo dimostrato alcun coinvolgimento di NF-kappa e, B, SAPK / JNK e ERK1 / 2 nella inibizione di LPS-indotta TNF-alfa &; produzione Seladin-1. Il coinvolgimento di p53 è esclusa. La mutazione di Seladin-1 proteina provoca desmosterolosi, una rara malattia autosomica recessiva. 8 & ndash; 10 pazienti con desmosterolosi sono caratterizzati da osteosclerosi generalizzata, la formazione ossea anormale, più malformazioni congenite e gravi alterazioni neuropsicologiche. 8 & ndash; 10 Il presente studio dimostra che Seladin-1 down-regola la formazione degli osteoclasti e il riassorbimento osseo nei macrofagi LPS-stimolati e che RANKL e M-CSF augment Seladin-1. La formazione degli osteoclasti LPS-indotta dipende TNF alpha &; 14,15 ed è ulteriormente aumentata da TNF-alfa esogeno & ;. Considerando che la LPS-indotta TNF-alfa &; la produzione è regolata negativamente da Seladin-1, Seladin-1 si consiglia di inibire LPS-indotta la formazione degli osteoclasti ed il riassorbimento osseo tramite ridotto TNF-alfa &; produzione. Potrebbe essere di interesse per studiare il ruolo del TNF-alfa &; sulla patogenesi della desmosterolosi, anche se il nostro sistema sperimentale non corrisponde necessariamente alla patogenesi di pazienti con desmosterolosi. Molte proteine controllano TLR segnalazione al fine di garantire la forza appropriata e la durata delle risposte immunitarie in immunità innata. La segnalazione TLR è regolata da proteine di segnale tra cui IRAKM, ST2, SIGIRR, SOCS1 il CYLD soppressore del tumore e A20. 22 cellule mancanti una di quelle proteine producono un livello superiore di citochine pro-infiammatorie di stimolazione TLR. Ringraziamenti informativa ausiliario
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